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>   首页   >   支持   >   实验指南   >   ABGENT常规单克隆抗体制备流程   
1免疫动物:选取健康Balb/c小鼠一只。
2佐剂:首先用完全弗氏佐剂(CFA, Sigma),后用不完全弗氏佐剂(IFA, Sigma)。
3免疫原:蛋白或KLH偶联的多肽。每次免疫使用50-100μg免疫原。
4免疫:用PBS稀释免疫原,然后与相应的佐剂1:1混合。抗原和佐剂完全混合形成稳定的乳化剂,用注射器抽取抗原混合物,于小鼠皮肤下进行多点皮下注射。每点注射0.05-0.1ml。这样免疫原可以持久存在从而提高免疫应答,直到达到要求的效价。
5 第0天 眼眶静脉丛采阴性血清,50ul/只;
第1天 免1:完全弗氏佐剂(CFA)混合的120μg抗原免疫小鼠;
第14天 免2:不完全弗氏佐剂(IFA)混合的60μg抗原免疫小鼠;
第28天 免3:不完全弗氏佐剂(IFA)混合的60μg抗原免疫小鼠;
第35天 采1:血清检测ELISA,1:4000的OD值大于1.0,转阳,融合前3天进行小鼠加免;若低于1.0,继续免疫采血;
第41天 采2;
第42天 免4,免疫方法和免疫剂量同免3。采血是一周采一次,免疫是两周免疫一次。当血清检测的结果阳性后,进行融合。融合前3天进行小鼠加免,将溶解在PBS中的60μg抗原皮下免疫小鼠。
6杂交瘤融合和筛选:加免3天之后的小鼠,摘眼球取阳性血清,将脾细胞和骨髓瘤细胞F0通过PEG进行融合。培养7天后,用抗原对融合的杂交瘤克隆的上清进行筛选,检测它们的特异性和敏感性,一般都需要进行初筛和复筛。ELISA阳性的克隆可再进行WB检测,筛选出来的克隆至少还需要亚克隆两次,得到稳定分泌抗体的单克隆。
7大规模抗体生产:筛选得到阳性克隆最后进行大规模上清培养(每个克隆1L)或者生产腹水(每个克隆5只小鼠)。用蛋白A/G对培养液或腹水进行纯化,得到纯化后的抗体,纯化抗体的纯度大于90%。平均每克隆可以得到3-5mg 抗体。