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>   首页   >   支持   >   实验指南   >   ABGENT细胞/组织裂解液制备流程   

1.试剂和溶液

RIPA buffer:20mM Tris (pH 7.5),150mM NaCl,1mM Na2EDTA,1mM EGTA,2.5mM sodium pyrophosphate,1mM beta-glycerophosphate disodium salt hydrate,1mM Na3VO4,1µg/ml leupeptin hemisulfate salt,1% sodium deoxycholate,1% Triton X-100,1mM PMSF

2.实验步骤--细胞裂解液制备

1细胞收集:选择对数生长期的细胞,用预冷的PBS洗涤细胞,3000rpm,离心5min,弃上清;
2细胞裂解:将细胞沉淀轻轻弹散,然后加适量预冷的RIPA buffer和PMSF进行裂解(1个100mm直径细胞培养皿加入100-200μl裂解液, 1ml RIPA buffer加10μl PMSF),放置于冰上,轻轻吹散细胞悬液,放置4℃冰箱或冰水混合物中裂解40-60min;
3超声处理:首先观察裂解情况,如液体澄清说明裂解充分无需进行超声处理,否则裂解液不充分需要进行超声处理。方法如下:
设置参数:次数10-30次,每次时间5-10s,取出4℃冰箱或冰浴的细胞裂解悬液置于超声仪里(冰上超声),超声完毕后需观察细胞裂解液是不是澄清,如果有浑浊,需再次进行超声;
4离心测蛋白浓度:13000rpm 4℃,离心8min,取上清。另取10μl样品用Coomassie Brilliant Blue法测定蛋白浓度;
5细胞裂解液处理:加入适量的5*Loading Buffer,混匀后沸水浴5-10min,取出0.5ml样品进行电泳及WB检测,其它分装置于-20℃保存。

3.实验步骤—组织裂解液制备

1取组织:新鲜或从-80℃冰箱/液氮中取出需要制备裂解液的组织,待组织解冻后放在盛有PBS液的培养皿中,用镊子夹住组织洗净组织中残留的血,并且尽可能除去脂肪和外膜;
2把洗净的组织放入培养皿中,用剪刀将组织剪成小块(尽可能的小);
3裂解:将剪碎的组织小块转移至研磨器中,在冰浴中进行研磨一定次数后,加入适量预冷的RIPA buffer和PMSF继续研磨至组织无明显块状即可(一般 1ml RIPA buffer加10μl PMSF);
4将研磨好的组织裂解悬液转移至干净的离心管中,再用少量的RIPA buffer和PMSF清洗研磨器并倒入离心管中,冰浴中放置40-60min, 充分裂解,可间隔摇晃离心管或吹打数次;
5超声处理:首先观察裂解情况,如液体澄清说明裂解充分无需进行超声处理,否则裂解液不充分需要进行超声处理。方法如下:
设置参数:次数10-30次,每次时间5-10s,取出4℃冰箱或冰浴的细胞裂解悬液置于超声仪里(冰上超声),超声完毕后需观察细胞裂解液是不是澄清,如果有浑浊,需再次进行超声;
6离心测蛋白浓度:13000rpm 4℃,离心8min,取上清(小心表面的脂肪和管底的组织碎片),另取10μl样品用Coomassie Brilliant Blue法测定蛋白浓度;
7组织裂解液处理:加入适量的5*Loading Buffer,混匀后沸水浴5-10min,取出0.5ml样品进行电泳及WB检测,其它分装置于-20℃保存。