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实验流程--多肽制备

固相多肽合成就是不断地在固相载体上加入α-氨基和侧链基团被保护的氨基酸。FMOC基团是用来保护α-氨基中的N的，去除保护基团后，再加入第二个氨基酸。产生的多肽通过一个连接臂将C端连接在树脂上，它可以被裂解下来。通常情况下，在多肽从树脂上裂解下来的同时去除侧链保护基团，一般采用哌啶去FMOC保护基团，肽树脂的裂解和侧链保护基团去除一般用强酸，比如三氟乙酸，N,N-二甲基甲酰胺（DMF）是树脂去保护、氨基酸反应和洗涤的首选溶剂。

1. 合成步骤：

   步骤	溶液或溶剂	循环数	时间
   1	DMF	2次	30s
   2	含20%哌啶DMF溶液	1次	5min
   3	DMF	1次	30s
   4	含20%哌啶DMF溶液	1次	10min
   5	DMF	6次	30s
   6	Fmoc-AAF HBTU HPBt NMM15	1次	30-60min
   7	DMF	2次	30s

   HBTU: 2-(1H-Benzeotriazole-1-yl)-1,1,3,3,-tetramethyluroniumhexafluorophosphate
   HOBt: N-Hydroxybnzotrizole•H₂O
   NMM: N-methylmorpholine

2. 从树脂上分离下来：

   步骤	溶液或溶剂	循环数	时间
   1	DMF	2次	30s
   2	含20%哌啶DMF溶液	2次	10min
   3	DMF	6次	30s
   4	DCM	6次	30s
   5	DCM	6次	30s
   6	干燥	1次	10min
   7	试剂K	1次	2.5h

   试剂K：TFA/苯甲硫醚/EDT/苯酚/水=87.5/5/2.5/2.5/2.5（v/v）

3. 纯化： RP-HPLC纯化

   HPLC条件：

   • 流动相：
     A）0.1%TFA水溶液
     B）0.1%TFA乙腈溶液
   • 梯度：A/ B（90/ 40）到A/ B（40/ 90）30min
   • 流速：1ml/min
   • 温度：室温（23℃）
   • 检测：214nm的紫外
   • 样品：冻干的粗品

   步骤：

   1. 将粗品溶解在流动相中
   2. 注入20-30mg（2-2.5ml）样品
   3. 将主峰收集到50ml管中
   4. 冻干

4. 鉴定：

   LC/MS条件：

   • 流动相：
     A）0.05%TFA水溶液
     B）0.1%TFA乙腈溶液
   • 梯度：A/ B（90/ 10）到A/ B（40/ 60）15min
   • 流速：1ml/min
   • 温度：室温（23℃）
   • 检测：214nm的紫外
   • MS API：ESI