实验流程--细胞/组织裂解液

溶液准备
2×样品缓冲液：130mM Tris-HCl ( pH8.0 ) , 20% ( v/v ) 甘油 , 4.6% ( w/v ) SDS , 0.02% 溴酚蓝 , 2% DTT
PBS ( pH7.4 ) ：10mM Na₂HPO₄ , 1.8mM KH₂PO₄ , 50mM NaCl , 2.7mM KCl
RIPA缓冲液：50mM Tris-HCl（pH7.4） , 150mM NaCl , 1mM EDTA , 1%Triton×100 , 1%去氧胆酸钠 , 0.1%SDS , 1mM PMSF , 1μg/ml 牛胰蛋白酶抑制剂 ( aprotinin ) , 1μg/ml亮抑蛋白酶肽 ( leupeptin )
裂解液缓冲液：10mM Tris-HCl（pH7.4） , 0.15M NaCl , 5mM EDTA(pH8.0) , 1%Triton×100;使用前加5mM DTT,0.1mM PMSF异丙醇和5mM ε-氨基己酸
裂解液的制备
1. 制备细胞裂解液：
  1. 收集胰蛋白酶消化的细胞并离心，用PBS清洗。
  2. 用100μl RIPA缓冲液冰浴溶解沉淀10min（每500000个细胞20μl RIPA缓冲液）。
  3. 10000rpm，4℃离心10min，取上清转移至新管。
  4. 用考马斯亮蓝法检测蛋白质浓度。
  5. 用裂解缓冲液将溶液浓度调到5mg/ml，每小瓶中放100μl，-80℃储存。
  6. 按照1：1体积比混合2×样品缓冲液，煮沸5min后，室温放置5min。
  7. 短时离心后点样电泳检测。　
2. 制备组织裂解液：
  1. 在制备过程中一直将溶胞液或组织放在冰上。
  2. 切开组织，称取组织1.5g于PBS中清洗。
  3. 在RIPA缓冲液中剪碎组织后，转移到匀浆器中，加足5ml RIPA缓冲液，研磨20min。
  4. 将研磨液转移到1.5ml的离心管中，14000rpm，4℃离心10min。
  5. 取上清液作为完整的组织裂解液。
  6. 用考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度。
  7. 用裂解缓冲液将溶液浓度调到5mg/ml，每小瓶中放100μl，-80℃储存。
  8. 按照1：1体积比混合2×样品缓冲液，煮沸5min后，室温放置5min。
  9. 短时离心后点样电泳检测。