实验流程--免疫组织化学（HRP-DAB系统）

溶液准备：
PBS ( pH7.4 ) ：10mM Na2HPO4 , 1.8mM KH2PO4 , 50mM NaCl , 2.7mM KCl
封闭缓冲液：3%BSA-PBS
程序：
1. 对石蜡切片进行脱蜡和水化：3×10min 二甲苯，5min 100%乙醇，5min 95%乙醇，5min 80%乙醇，5min 70%乙醇，3×5min PBS。
2. 修复抗原，PBS洗涤三次，每次5min。
3. 室温下，将玻片在3%H₂O₂-甲醇溶液中浸泡15min封闭内源性过氧化物酶，然后用PBS洗涤三次，每次5min。
4. 加入一抗（用3%BSA-PBS封闭液1：50稀释一抗），37℃湿盒孵育1h。
5. 加入Post-blocking室温湿盒孵育30min，然后用PBS洗涤三次，每次5min。
6. 加入稀释好的辣根过氧化物酶（HRP）标二抗，室温下湿盒孵育30min。
7. 用PBS洗涤玻片5次，每次5min。
8. 按照DAB试剂盒说明添加显色液，避光显色30s-5min。用蒸馏水终止显色反应。
9. 苏木精进行复染色3min，用蒸馏水冲洗。
10. 立即进行脱水和透明：1×5min 70%乙醇，1×5min 80%乙醇，1×5min 90%乙醇，1×5min 100%乙醇，2×10min 二甲苯。
11. 中性树胶封片。
抗原修复方法：
1. 柠檬酸钠法：
  1. 把玻片放在玻璃固定架上，再将架子放在盛有600ml的10mM柠檬酸钠(pH6.0）的容器中。
  2. 微波中高火6-8min。
  3. 室温冷却。
  4. 用PBS洗涤3次，每次5min。
2. 蛋白酶K法：
  1. 配制新鲜溶液：
  2. 25μl 20mg/ml蛋白酶K
  3. 2.5ml 1MTris-HCl（pH8.0）
  4. 0.5ml 0.5M EDTA（pH8.0）加水定容到50ml
  5. 37℃下，将玻片放在架子上孵育5min（蛋白酶K不要预热）。
  6. 用PBS洗涤3次，每次5min。
3. 尿素法：
  1. 把玻片放在玻璃固定架上，再将架子放在盛有600ml 的1M尿素（新鲜配制）的容器中。
  2. 微波10min，20min或者30min，每5min补充一次蒸发掉的水。
  3. 冷却30min到1h。
  4. 用蒸馏水洗涤4次，每次3min，再用PBS洗涤3min。